Đảm đương cương vị Chủ tịch Ngân hàng Nhà nước và Bộ trưởng Công nghiệp trong chính phủ cách mạng Cuba, Che luôn kêu gọi xây dựng xã hội mới, nơi con người mới biết sống vì mọi người, vì chủ nghĩa quốc tế.

Tháng 3 năm 1963, mặc dù bị bệnh hen hành hạ từ nhỏ, Che quyết định từ nhiệm mọi cương vị kể cả quyền công dân Cuba để lên đường thực hiện mong muốn tiếp tục được cống hiến cho sự nghiệp tranh đấu giành tự do của các dân tộc bị áp bức. Ông từ biệt vợ con để lên đường tiếp tục cuộc cách mạng giải phóng Mỹ Latinh, để "Tạo ra một, hai, ba và rất nhiều Việt Nam" - như lời ông nói- vào thời khắc cuộc chiến tranh chống Mỹ ở Việt Nam bước sang giai đoạn quyết liệt.

Quyết định ra đi được đưa ra vào đúng lúc con đường công danh đang rộng mở đối với Che khiến dư luận không khỏi hồ nghi có những khuất tất. Đã không ít ý kiến cho rằng: đằng sau sự ra đi đó có sự ép buộc khiên cưỡng của 2 anh em nhà Castro... Tuy nhiên, trong bức thư gửi Chủ tịch Fidel mà sau được chính Fidel đọc trong buổi lễ thành lập Đảng Cộng sản Cuba, Che đã nói rõ việc ông thôi giữ cương vị lãnh đạo là hoàn toàn tự nguyện, thể theo tiếng gọi của trái tim yêu tự do, khao khát hòa bình và cống hiến cho sự nghiệp cách mạng, sự nghiệp giải phóng loài người khỏi áp bức và bất công. Thư viết:[5]

Tôi cảm thấy đã hoàn thành phần nghĩa vụ của mình liên quan đến cách mạng Cuba trên lãnh thổ Cuba và tôi xin từ biệt anh, từ biệt các đồng chí, từ biệt nhân dân của anh, mà cũng đã trở thành của tôi. Tôi chính thức từ bỏ mọi chức vụ trong ban lãnh đạo đảng, chức bộ trưởng, cấp bậc tư lệnh, tư cách là người Cuba...Những miền đất khác trên thế giới đang đòi hỏi sức lực khiêm tốn của tôi... Tôi để lại một đất nước đã chấp nhận tôi như một người con... Trên những chiến trường khác tôi sẽ mang theo niềm tin mà anh đã vun đắp cho tôi, mang theo tinh thần cách mạng của nhân dân tôi, mang theo ý chí thực hiện nghĩa vụ quan trọng nhất: chiến đấu chống lại chủ nghĩa đế quốc ở bất kỳ nơi nào...Dù đến bất cứ đâu, tôi cũng sẽ cảm nhận trách nhiệm của một người cách mạng Cuba và sẽ hành động như vậy...Hẹn đến ngày toàn thắng. Tổ quốc hay là chết!"

Đầu tháng 4 năm 1963, Che cùng một số người khác rời Cuba đi Congo. Tại đây, sau những dự định không thành, họ đã rút đi (tháng 11 năm 1965). Tháng 3 năm 1966 Che đến Praha (Tiệp Khắc), rồi bí mật trở về Cuba (tháng 7 năm 1966) lên kế hoạch cho chiến dịch Bolivia.

Đầu tháng 10 năm 1967, Che và một số chiến hữu dùng thông hành giả để đến La Paz (thủ đô của Bolivia). Từ La Paz họ bí mật vào rừng thành lập một nhóm du kích quân, với mục đích tạo nên một hạt nhân đấu tranh thí điểm nhằm giải phóng cả châu Mỹ Latinh. Sau 11 tháng hoạt động - từng chi tiết hoạt động được Che ghi lại trong nhật ký mà sau này được phổ biến rộng rãi với tên "Nhật ký của Che Guevara tại Bolivia" - dần dần tổ chức của ông bị bại lộ và cuối cùng thất bại.

Với chiến thuật phục kích, tổ chức của Che đã giành thắng lợi một số trận nhỏ. Nhưng do có phần tử nội phản, căn cứ và hoạt động của tổ chức bị phát hiện. Tránh sự truy quét của kẻ địch, tổ chức quyết định chuyển căn cứ. Tổ chức của ông bị cô lập. Mọi người bị thiếu lương thực trầm trọng và bệnh tật. Chính ông bị cơn suyển là căn bệnh cố hữu hành hạ mỗi lúc một nguy ngập vì thiếu thuốc men. Cả nhóm phải giết ngựa, lừa là phương tiện tải quân trong rừng, để ăn. Các đồng chí thân cận bên ông dần dần bị tử trận. Cuối cùng, ông bị bắt ngày 7 tháng 10 năm 1967 trong tình trạng bị thương ở chân, sau một cuộc giao tranh trong lúc ông và các chiến hữu đang tìm đường thoát ra khỏi rừng ở vùng Quebrada del Yuro. Ông thậm chí không thể tự sát: khẩu carbine của ông đã bị một loạt đạn pháo bắn nát. Ông bị giam giữ suốt đêm tại ngôi trường trong làng. Trong tình trạng tuyệt vọng, Che vẫn giữ vững niềm tin về tính đúng đắn của sự nghiệp mà ông theo đuổi.[6]